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    非洲豬瘟100%的致死率令養(yǎng)殖場措手不及，侵入豬身體里的病毒為什么可以長驅(qū)直入？有沒有什么辦法能夠阻止它的入侵呢？

  日前，我國復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘建華課題組與李繼喜課題組合作，研究解析了非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路上一種關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《自然·通訊》。

  這種關(guān)鍵酶是連接酶，被稱為基因“針線”，用于將不同的DNA片段連接起來。這次通過解析非洲豬瘟病毒DNA連接酶的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)找到了非洲豬瘟病毒的保守位點(diǎn)，為針對非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路蛋白的藥物設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

  斷尾求生，病毒躲過宿主免疫系統(tǒng)

  “人們會發(fā)現(xiàn)，患了豬瘟的病豬會發(fā)生脾臟腫大，脾臟是重要的免疫器官，那說明它的免疫系統(tǒng)‘奮力作戰(zhàn)’了?！崩罾^喜說，但是非洲豬瘟病毒很聰明，在進(jìn)入體內(nèi)后會不斷變化，讓免疫系統(tǒng)“抓不到”。

  它的變化很像壁虎的“斷尾求生”。“對于宿主免疫系統(tǒng)要攻擊的DNA片段，它會剪切掉，然后再重新‘長出來’?！崩罾^喜說?！伴L出來”意味著DNA的延長、重組，這個過程需要兩種DNA聚合酶(X和P)和一種DNA連接酶。

  “有這3種酶參與的整個過程形成了一套完整的DNA修復(fù)通路?！崩罾^喜說，團(tuán)隊(duì)已經(jīng)解出了其中的一種聚合酶，文章2017年發(fā)表，揭示了聚合酶X擁有一個獨(dú)特的磷酸根識別位點(diǎn)；另一種聚合酶的研究已經(jīng)收尾，正在進(jìn)行結(jié)果整理和論文編寫工作，至此團(tuán)隊(duì)已經(jīng)“全面打通”整個通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

  病毒更狡猾的地方在于它新長出來的DNA片段和原來的不同，使得宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)措手不及，難以鎖定攻擊目標(biāo)。非洲豬瘟病毒也是如此，其基因組修復(fù)時會發(fā)生突變，讓免疫系統(tǒng)無法精準(zhǔn)識別，進(jìn)而使得針對它們的狙擊，無法奏效。

  分辨率高，晶體法定格“繡娘”手法

  俗話說，“萬變不離其宗”。既然病毒DNA修復(fù)時有千變?nèi)f化，有沒有可能找到所謂的“宗”即保守區(qū)呢？

  這就要對關(guān)鍵酶進(jìn)行高精度的結(jié)構(gòu)解析。團(tuán)隊(duì)選擇了X-射線晶體學(xué)方法，與聲名鵲起的冷凍電鏡方法相比，前者的分辨率更高，且一旦摸索好條件后，更易重復(fù)。

  結(jié)晶條件的摸索卻是非常艱難的過程?！拔覀冇没蚬こ痰姆椒?，讓非洲豬瘟病毒的連接酶在工程菌中大量表達(dá)，通過純化柱等方法將蛋白純化出來。”李繼喜說。這個時候目標(biāo)蛋白還在溶液中，與同自己性質(zhì)、分子量相近的“兄弟姐妹”在一起。

  團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了上千次相關(guān)參數(shù)的摸索，最終得到了均一性高的完美晶型，通過X光衍射、三維重構(gòu)等方法，獲得了分辨率達(dá)到2.5埃的連接酶分子結(jié)構(gòu)。

  在超高分辨率下，科學(xué)家可以看到蛋白質(zhì)中每個氨基酸單體的相互作用、電子密度云的情況，目擊氫鍵間的相互連接，從而判斷和預(yù)測作為“繡娘”的DNA連接酶將用哪些可能的針法將什么樣的DNA片段連接起來。

  親見“凹造型”，鎖定藥物設(shè)計(jì)潛力點(diǎn)

  預(yù)測之后，必須親見。利用X-射線晶體學(xué)方法獲取酶與DNA作用的“影像”，將對酶與底物相互作用時的“凹造型”一目了然。

  為此，根據(jù)已經(jīng)獲得的連接酶分子結(jié)構(gòu)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了10幾種可能的DNA片段，試試連接酶的“功力”?！癉NA片段有長有短，含有的堿基對數(shù)量8到20個不等?！崩罾^喜說。

  對于這些不同的DNA底物分子，連接酶表現(xiàn)了不同的活性。從本質(zhì)上說，它們之間的反應(yīng)是酶促反應(yīng)。分析發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒連接酶在底物催化位點(diǎn)附近具有一些明顯不同的氨基酸組成。蛋白突變、體外DNA結(jié)合以及活性研究顯示，催化位點(diǎn)附近的氨基酸對其與DNA形成復(fù)合物及活性至關(guān)重要。

  李繼喜解釋道：“單獨(dú)的酶的構(gòu)象可以想象成一個三節(jié)棍，當(dāng)和DNA作用時，這個三節(jié)棍的三段會發(fā)生變化，收攏到一起形成一個‘口袋’狀，把DNA關(guān)在里面，促成DNA連接反應(yīng)的進(jìn)行?！?/span>

  高分辨率結(jié)構(gòu)顯示，該連接酶在N-端具有一個獨(dú)特的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NTD)，該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝Y(jié)合十分重要。

  “這就好比‘口袋’入口的地方有個把門的，這個獨(dú)特的結(jié)合結(jié)構(gòu)域‘認(rèn)可’了，才能被連接酶納入到口袋中，促進(jìn)DNA的反應(yīng)，如果這個‘把門’的不同意，就無法進(jìn)行DNA的‘縫合’工作。”李繼喜說。

  可以針對這個獨(dú)特的位點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，阻斷連接酶的工作，進(jìn)而掌握抑制病毒的方法?！耙延醒芯堪l(fā)現(xiàn)病毒的成熟顆粒中含有連接酶，也就是說病毒已經(jīng)進(jìn)入了宿主細(xì)胞，并進(jìn)行了翻譯和組裝之后，才會啟動連接酶的翻譯工作?！崩罾^喜說，因此以該位點(diǎn)為靶點(diǎn)的藥物并不能預(yù)防非洲豬瘟的感染，而是對豬瘟進(jìn)行治療。目前，該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開始與北大團(tuán)隊(duì)合作開啟化合物的篩選工作。